В.Т. Вертушков

Предшественники возрастного пигмента липофусцина - возможная роль в процессах радиационного поражения и защиты

 

По мере повышения дозы облучения крыс и мышей способность селезенки к деполимеризации липополимеров снижается, что приводит к ослаблению иммунологической активности. Накапливающиеся в организме после облучения липополимеры могут рассматриваться как радиотоксины. Инъекция животным перед облучением радиопротекторов (цистеамин, мексамин и др.) также приводит к образованию в организме небольших количеств липополимеров. При облучении эти липополимеры, выполняя роль антиоксидантов, тормозят окислительные процессы в липидной фазе клеток.

 

Полимерные соединения являются главным продуктом термического окисления масел при 200°-300°С. Чем выше температура окисления масла, тем меньше максимальная концентрация перекисей, достигаемая в ходе окисления.  При температурах выше 200°С концентрация перекисей близка к нулю и не увеличивается при окислении. Perkins [1], обобщив результаты широкого ряда исследований по ауто- и термоокислению жиров, полагает, что окисление этиллинолеата ведет к появлению конъюгированных гидроперекисей, которые могут циклизоваться с последующим образованием полимеров. Циклизация и полимеризация перекисей являются причиной появления окраски масел. Максимальная молекулярная масса полимеров, образующихся при перегревании кукурузного масла (200°С, 24 часа), превышает 10.000 дальтон [2].

Обнаружено [3], что добавление к олеиновой кислоте,  окисляющейся при относительно невысокой температуре (75°С, в присутствии ионов Fe²⁺ и кислорода воздуха) ряда радиопротекторов - катехоламинов, серотонина, гистамина, цистамина, цистеамина, мексамина, аминоэтилизотиурония, пропилгаллата, гидроксиламина приводит к быстрому накоплению в олеиновой кислоте окрашенных полимерных продуктов. Особенно активны в этом отношении биогенные амины. Так, после введения в олеиновую кислоту серотонина (в 75%-ном метиловом спирте) или адреналина (в капле ледяной уксусной кислоты) в концентрации 2,5·10^-3mol/l количество липополимеров через 2-3 мин составляло 1,3 - 1,5% от исходной массы кислоты. Фракционирование на колонке с сефадексом LН-20 (элюирующая смесь хлороформ-метанол 1:1), калиброванной по полиэтиленгликолю показало, что максимальная молекулярная масса полимеров превышает 6.000 дальтон. Полученные данные привели к выводу, что добавление перечисленных выше радиопротекторов к олеиновой кислоте равнозначно повышению температуры ее окисления до 200°-400°С (в зависимости от добавленного радиопротектора). То-есть, радиопротекторы являются катализаторами окислительной полимеризации ненасыщенных жирных кислот. При этом действие радиопротекторов на жирные кислоты отличается специфичностью. Полимеры, образующиеся в олеиновой и линолевой кислотах под влиянием разных радиопротекторов, различаются между собой по спектрам поглощения и флуоресценции, а также биологическому действию [4-7].

Анализируя структуру наиболее эффективных радиозащитных препаратов Мозжухин и Рачинский [8] отмечают, что к активным группировкам в структуре радиопротекторов можно отнести  амино-меркапто- и окси- группу. Для того, чтобы препарат обладал выраженными защитными свойствами, необходимо сочетание вышеупомянутых групп между собой или сочетание их с другими группами, типа имидазольной, индольной или гуанидовой. Необходимо также, чтобы расстояние между активными группами не превышало 2-3 углеродных атома. Препараты такой структуры, входя в соединение с какой-либо химической группой, одновременно обеими своими активными группами будут образовывать наиболее устойчивые пяти- и шестичленные кольца. В то же время препараты, в которых активные группы разделены одним или четырьмя и более атомами углерода, устойчивых колец образовать не могут. Авторы предполагают, что в способности образовывать циклические соединения лежит одна из сторон механизма защитного действия радиопротекторов [8]. Такими циклическими соединениями являются, по-видимому, полимерные продукты окисления ненасыщенных жирных кислот, образующиеся из перекисей под действием радиопротекторов.

Внутрибрюшинная инъекция белым мышам радиопротекторов (включая восстановленный глутатион и цистеин) в радиозащитных: дозах также индуцирует появление в тканях и органах полимерных продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот. Липиды из тканей извлекали хлороформ - метанольной смесыо 2:1 [9]. Присутствие окрашенных полимеров в растворе липидов в хлороформе определяли по поглощению при 400nm. Концентрация липидов тонкого кишечника 1%, липидов остальных тканей 0,15% (рис. 1,2) [5, 10]. Из рисунков видно,  что максимум концентрации липополимеров в ряде тканей приходится по времени на период максимальной защиты этими радиопротекторами. Так, после введения мышам аминоэтилизотиурония (150mg/kg веса животных) максимум поглощения при 400nm обнаруживается через 10-15 мин в селезенке и костном мозге. Инъекция мышам адреналина (4mg/kg) вызывает накопление липополимеров в те же сроки в крови и тонком кишечнике. Эти результаты привели к предположению, что защитное действие используемых в настоящей работе радиопротекторов основано на образовании ими в липидных структурах клеток полимерных продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот. Если радиозащитное действие цистамина сохраняется в течение нескольких часов после его введения [11], то и концентрация липополимеров в тканях  мышей удерживается на высоком уровне в течение 3-х часов наблюдения (рис. 3) [5]. Защитный эффект липополимеров основан, по-видимому, на их способности тормозить образование перекисных соединений в липидной фазе клеток облучаемых животных (рис. 4) [10].

Для подтверждения этого предположения в олеиновую кислоту, окисляющуюся при 75°С, добавляли цистамин. Образовавшиеся липополимеры выделяли методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом LH-20. Анализ по методу [12] показал отсутствие тиогрупп в полимерах. В опытах использовали беспородных белых мышей-самцов весом 18-22g. Для получения каждой экспериментальной точки отбирали группу из 20-ти животных. Мышей облучали на рентгеновской установке РУМ-13, мощность дозы 34r/min. Облучение общее, однократное, со спины. Извлеченные из олеиновой кислоты липополимеры вводили животным внутрибрюшинно в 0,02ml оливкового масла в количестве 125-175mg/kg веса животных. Контрольным животным инъецировали оливковое масло. Время введения липополимеров - за 90min до облучения. Эффективность защитного действия определяли по числу выживших мышей к 30-м суткам.

Результаты опыта показали наличие четко выраженного защитного действия липополимеров с приближенным значением фактора уменьшения дозы 1,2 (рис. 5) [13]. Относительно невысокое значение фактора уменьшения дозы связано, по-видимому, с избирательным поглощением липополимеров лимфой животных [14], селезенкой [4] и, возможно, печенью.

Полученные данные подтверждают теорию, согласно которой в основе биологического действия ионизирующей радиации лежат самоускоряющиеся цепные реакции окисления в липидных структурах клеток [15-19]. Количество перекисей, образующихся при облучении метилолеата и метиллинолеата, растет в соотношении, прямо пропорциональном дозе облучения [20]. Липополимеры, появляющиеся в липидной фазе клеток под влиянием радиопротекторов, понижают в процессе облучения скоростъ образования перекисей ненасыщенных жирных кислот, уменьшая тем самым эффективную дозу облучения. В результате, при одной и той же дозе облучения количество перекисей меньше в тех липидах, которые содержат липополимеры. Отметим также, что в процессе окислительной полимеризации ненасыщенных жирных кислот под влиянием радиопротекторов, практически сводится к нулю уровень липидных перекисей, обнаруженных в норме в субклеточных структурах [21, 22].

В течение пяти суток после тотального рентгеновского облучения мышей в дозе 750r в селезенке, костном мозге, крови появляются два четко выраженных максимума концентрации липополимеров, регистрируемых по поглощению при 400nm в растворе липидов тканей в хлороформе. Первый максимум приходится на время 6-12 часов после облучения, второй, более значительный, на 3-5 сутки (рис. 6) [3]. Появление первого максимума совпадает по времени с развивающимся поражением и деструкцией клеток кроветворных органов. Второй подъем концентрации липополимеров коррелирует с дегенеративными изменениями и массовой гибелью клеток слизистой кишечника (кишечный синдром). Фракционирование липидов селезенки на колонке с сефадексом LH-20 показало, что максимальная молекулярная масса липополимеров превышает 4.000 дальтон. Содержание липополимеров в селезенке на 4-е сутки после облучения составляло до 40% от общей массы липидов селезенки. IIри этом наблюдается визуально темно-красный цвет раствора липидов селезенки в хлороформе.

Появление липополимеров в тканях облученных животных есть результат  деятельности общей системы первичного реагирования, оповещения и защиты организма [23]. Отдельными звеньями этой системы являются: 1) диффузная эндокринная система [24], гормонопродуцирующие клетки которой рассеяны в эпителиалъных и соединительных тканях фактически всех органов; 2) иммунная система, 3) органы чувств и рецепторы эпителиальных тканей, связанные с пептидергическими нейронами нервной системы.

Иммунологическая реакция активируется при действии на организм любого стресс-фактора, инициирующего повреждение и деструкцию клеток тканей [7]. В ответ на повреждение тканей (в частности, на поражение кроветворных органов и кишечника ионизирующей радиацией) клетки местной диффузной эндокринной системы реагируют выделением избыточных количеств биогенных аминов. В активации диффузной эндокринной системы участвует, по-видимому, гипофиз - адреналовая система (гормоны коры надпочечников). В состоянии стресс-реакции организма высокие концентрации катехоламинов, серотонина, гистамина действуют как катализаторы окислительной полимеризации ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов плазматической мембраны и мембран субклеточных структур. Поскольку липиды в мембранах ассоциированы с белками, то результатом действия массированных доз биогенных аминов на клетки является образование окрашенных липопротеинов полимерной структуры. Значительная часть липопротеинов, образующихся в плазматической мембране, отрывается от клеток и поступает в лимфу, лимфатические узлы, селезенку, печень. (Липополимеры, образующиеся в цитоплазме, формируют, в конечном итоге, липофусциновые гранулы). В селезенке полимерные липопротеины поглощаются макрофагами, где липополимеры подвергаются деструктуризации [7]. Макрофаги представляют высвобождающиеся белковые антигены Т- лимфоцитам, что инициирует антигенспецифический иммунный ответ. Способностью к деструкции липополимеров обладают, возможно,  костный мозг и печень животных.

Отметим, что повреждение активно пролиферирующих клеток кроветворных органов и слизистой кишечника обусловлено действием перекисей ненасыщенных жирных кислот, количество которых растет пропорционально дозе облучения. Последующее образование липополимеров в организме облученных мышей означает, что содержание перекисей липидов в поврежденных тканях близко к нулю.

Имеются основания полагать, что способность селезенки тотально облученных животных к деструкции липополимеров нарушается. Баракина [25, 26] изучала закономерности развития лучевого поражения в селезенке мышей. Результаты опытов показали следующее:

1) Если после тотального облучения мыши в дозе 1000r селезенку хирургически отделить и оставить ее в брюшной полости, то через 4 часа в тканях такой селезенки деструктивных изменений нет. При отделении части селезенки некротические изменения через 4 часа наблюдаются только в той части,  которая связана с организмом.

2) Наложение лигатуры на 4 часа на сосудисто-нервный пучок селезенки сразу после  облучения предотвращает некротические изменения в клетках селезенки. Снятие лигатуры приводит к развитию типичных некрозов, но они развиваются медленнее, чем некрозы без предварительного наложения лигатуры.

3) При введении в селезенку необлученной мыши суспензии клеток облученной in vitro селезенки в месте инъекции через 4 часа наблюдаются очаги некротических клеток. В контроле (инъекция взвеси клеток необлученной селезенки) некрозов нет.

На основании этих фактов Баракина делает вывод, что “деструкция поврежденных радиацией клеток кроветворных органов наступает в результате выполнения ими каких-то специфических функций, протекающих в организме”.

Наличие у облученного животного значительных количеств липополимеров приводит к интоксикации организма. То-есть, липополимеры могут рассматриваться как радиотоксины. Токсическое действие термически окисленных жиров (200°-300°С) пропорционально содержанию в них полимерных продуктов [27, 28]. Введение в рацион полимерной фракции, выделенной из перегретого кукурузного масла, в количестве 2,5% от диеты, приводит к гибели животных в течение 7 дней [29]. Липополимеры, образующиеся в олеиновой кислоте под влиянием биогенных аминов угнетают дыхание гомогената печени свиней вследствие нарушения окислительного фосфорилирования [7].

По-видимому, при удалении у животных гипофиза или надпочечников диффузная эндокринная система не активируется. В результате этого, в тканях облученных животных развиваются цепные реакции окисления ненасыщенных жирных кислот с образованием высоко токсичных: перекисей, альдегидов, кетонов, эпоксидов. Чувствительность мышей с удаленными надпочечниками к летальному действию рентгеновских лучей является поразительной даже при низких дозах [30]. Если мышам с удаленными надпочечниками ежедневно вводится определенная доза экстракта коры надпочечника, то выживаемость их равна выживаемости здоровых мышей [31]. Белых крыс подвергали облучению различными дозами от 800r до 15.000r в пределах независимого от дозы интервала. При этом у животных с удаленными надпочечниками не наблюдали постоянного времени выживания и была найдена значительная зависимость продолжительности жизни от дозы облучения. В этом случае продолжительность жизни крыс находилась в обратно пропорциональной зависимости от количества перекисей липидов, образующихся при облучении различными дозами. У животных, получавших кортикостерон, полностью обнаруживали весь независимый от дозы интервал 3,5-дневног эффекта [32]. По-видимому, кортикостерон активирует диффузную эндокринную систему, что приводит к полимеризации перекисей липидов биогенными аминами.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 1. Динамика поглощения при 400nm в растворе липидов е хлороформе после инъекции мышам аминоэтилизотиурония в дозе 150мг/кг. 1 - кровь, 2 - селезенка, 3 - костный мозг, 4 - тонкий кишечник. Пунктирными линиями в данном и последующих рисунках обозначены величины поглощения в липидах соответствующих тканей контрольных (не облученных) мышей.

Рис. 2. Динамика поглощения при 400nm в растворе липидов в хлороформе после инъекции мышам адреналина в дозе 4 мг/кг. 1 - кровь, 2 - тонкий кишечник,  3 - селезенка, 4 - костный мозг.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 3. Динамика поглощения при 400nm в растворе липидов в хлороформе после инъекции мышам цистамина в дозе 150мг/кг. 1 - кровь, 2- тонкий кишечник, 3 - костный мозг, 4- селезенка.

Рис. 4. Кинетика накопления перекисей в олеиновой кислоте,  окисляющейся при 75⁰С с добавками веществ: 1 - серотонин, 2 - витамин Е, 3 - липополимеры, выделенные из селезенки мышей через 15 мин после инъекции аминоэтилизотиурония, 4 - полимеры, выделенные из олеиновой кислоты после ее взаимодействия с аминоэтилизотиуронием, 5 - олеиновая кислота, контроль.

Рис. 5. Влияние полимеров, образовавшихся в олеиновой кислоте под действием цистамина, на выживаемость облученных мышей к 30-м суткам. 1 - опыт, инъекция полимеров (125мг/кг) за 90 мин до облучения; 2 – контроль.

 

Рис. 6.  Динамика поглощения при 400nm в хлороформенном растворе липидов тканей мышей,  облученных в дозе 750r.  1- кровь, 2 - костный мозг,  3 - селезенка.

 

     ЛИТЕРАТУРА

     [1] Perkins E. G. 1960. Food Technol., 14, 508.
     [2] Perkins E. G., Taubold R., Hsich A. 1973. J. Am. Oil Chem., 50, 223.
     [3] Vertushkoff V.T., Ivanov I.I., Tarusov B.N. 1973. Радиобиология (Radiation Biology), 13, 3, 723.
     [4] Vertushkoff V.T., Ivanov I.I., 1974. Радиобиология (Radiation Biology), 14, 1, 39.
     [5] Ivanov I.I., Vertushkoff V.T., Tarusov B. N. 1974. Moscow University Bulletin. (Иванов И.И., Вертушков В.Т., Тарусов Б.Н., 1974. Вестник Московского университета), No.2, 39.
     [6] Vertushkoff V.T. 1977. Успехи современной биологии (Modern Biology Achievements), 83, 3, 357.
     [7] Vertushkoff V.T. 2002. 1. Predecessors of Lipofuscin Age Pigment - Probable Role in Biological Processes.
     [8] Moszhukhin A.S., Rachinsky F.U. 1964. Chemical Prevention of Radiation Damages, M. Atomizdat, p.219-220 (Мозжухин А. С., Рачинский Ф. Ю. 1964. Химическая профилактика радиационных поражений. М., Атомиздат, стр. 219-220).
     [9] Folch B.J., Lees M., Sloane-Stanley G.H. 1957. J. Biol. Chem., 226, 497.
     [10] Vertushkoff V.T., Ivanov I.I. 1973. High School Scientific Reports. Biological Sciences. (Вертушков В. Т., Иванов И. И. 1973. Научные доклады высшей школы. Биологические науки.). No. 7, 57.
     [11] Hollender A., Dodney K. 1956. In: Radiation Biology Matters. M., Foreign Literature Publishers, p. 182.
     [12] Sedlak J., Lindsay R. H. 1968. Anal. Biochem., 25, 2, 192.
     [13] Vertushkoff V. T. Радиобиология (Radiation Biology), 19, 3, 436.
     [14] Ueno A., Inone M., Sugai M., Bhalerno V., Kummerow F. A. 1960. Federation Proc., 19, 19.
     [15] Charana P., Phylpot A. 1954. J. Radiol. 27, 383.
     [16] Ivanov I. I., Balabuha V. S. etc. 1956. Metabolism under Radiation Thickness. M., Medgiz.
     [17] Chevalier A., Burg K. 1956. Symposium de Radiologie, Liege.
     [18] Tarusov B. N. 1957. Primary Processes of Radiation Damage. M., Medgiz.
     [19] Tarusov B. N. 1957. Fundamentals of the Biologic Action of Radioactive Radiation. M., Medgiz.
     [20] Chevalier A., Burg K. 1956. In: Radiation Biology Matters, p.11, M., Foreign Literature Publishers.
     [21] Placer Z. 1967. Nahrung, 11, 623.
     [22] Vladimirov U.A., Archakov A.I. 1972. Peroxide Oxidation of Lipids in Biologic Membranes. M., "Nauka".
     [23] Yaglov V.V., Lomonosova G. A. 1985. Успехи современной биологии (Modern Biology Ahievements), 99, 2, 264.
     [24] Feyrter F. Z. 1951. Mikr.-anat. Forshung, B. 57, S. 324.
     [25] Barakina N.F. 1958. Rep. Acad. of Sci. of the USSR, 121, 631.
     [26] Barakina N.F. 1959. Rep. Acad. of Sci. of the USSR, 125, 1141.
     [27] Friedman L., Shue G. M., Douglas C.D., Firestone D. 1961. Federation Proc., 20, 369.
     [28] Kummerow F. A. 1962. In: Lipids and Their oxidation. Westport, USA, 294.
     [29] Nanda B. S., Getty R. 1973. Exp. Geront., 28, 1.
     [30] Patt H.M., Brues A.M. 1954. Radiation Biology, v.1, p. 173.
     [31] Straube R.L., Patt H.M., Tyree E.B., Smith D.E. 1949. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 71, 539.
     [32] Rajewsky B. 1956. In: Radiation Biology Matters, p. 133, M., Foreign Literature Publishers.