В.Т. Вертушков

Предшественники возрастного пигмента липофусцина - возможная роль в биологических процессах

 

Липофусциновые пигменты возникают в организме при стрессовых ситуациях. Выбрасываемые при стрессе в кровь биогенные амины (адреналин, серотонин, гистамин и др.) подвергают свободнорадикальной окислительной полимеризации липиды патогенных микроорганизмов, патологических и нормальных клеток. Липополимеры, связанные с белками, избирательно поглощаются лимфоидными тканями, селезенкой, которые деполимеризуют липополимеры, высвобождая белки и представляя их как антигены.

 

Возрастной пигмент лппофусцин накапливается в организме животных и человека в норме, по мере их роста и старения. В зависимости от вида животного, возраста, условий образования и места локализации липопигменты различаются по гистохимическим и ультраструктурным характеристикам, спектрам флуоресценции и поглощения, растворимости в органических растворителях. Основными компонентами изолированных гранул возрастного пигмента сердечной мышцы человека и быка являются липиды - 20-50% сухого веса, белки 30-60% и  9-20% негидролизуемого вещества [1, 2]. В гранулах найдены также фрагменты мембран [З]. Результаты колоночной хроматографии липидной фракции возрастного пигмента показали, что она на 75% состоит из фосфолипидов.

Откладывание пигмента усиливается при Е-авитаминозе, гипоксии и гипероксии, атеросклерозе, рефлекторных воздействиях (например, при возбуждении оборонительного рефлекса у крыс во время приема пищи), после внутрибрюшной или подкожной инъекции жиров и масел, пролонгированного действия на животных адренокортикотропным гормоном, эстрогеном и диэтилстилбестролом, при гиподинамии, действии ионизирующей радиации, электрораздражении, температурном стрессе и др., а также при некоторых заболеваниях человека, характеризующихся поражением центральной нервной системы.

Аккумуляция пигмента при Е-авитаминозе отмечена в макрофагах и мышечных волокнах сердца крыс [4] и хомяков [5], фагоцитарных клетках соединительной ткани, макрофагах лимфы, селезенки и печени обезьян и хомяков. Полагают, что в селезенку и печень пигмент поступает из мышц животных [6]. Показано избирательное поглощение липопигмента лимфой животных [7]. Ускорение образования липопигмента наблюдается при  поступлении в организм животных чужеродных веществ - при скармливании ацетанилида, четыреххлористого углерода, при бензольном отравлении и др.

Большинство исследователей полагают, что пигменты липидной природы образуются в результате аутоокисления ненасыщенных жирных кислот и последующей полимеризации продуктов окисления. Окисление ненасыщенных жирных кислот ведет к появлению гидроперекисей, которые могут циклизоваться с последующим образованием полимеров[8]. In vivo в этот процесс включаются белки. Непосредственной причиной образования липофусцина считают повреждение липидной пероксидацией мембран клеточных органелл [9,10]. Железосодержащие соединения - гемоглобин, гемин, цитохром С и миоглобин рассматриваются как неспецифические катализаторы этого процесса. Полагают, что химический состав липофусцина не исключает функциональной роли его предшественников в биологических процессах [2, 11].

Полимерные соединения являются главным продуктом термического окисления масел при 200° - 300°С. Максимальная молекулярная масса полимеров, образующихся при перегревании кукурузного масла (200°С, 24 часа), превышает 10.000 дальтон [12]. Величина поглощения в жировых растворах в хлороформе в области 243-253nm находится в прямой зависимости от концентрации в жирах продуктов полимеризации [13].

Обнаружено [14], что добавление к олеиновой кислоте,  окисляющейся при относительно невысокой температуре (75°С, в присутствии ионов Ре + и кислорода воздуха), биогенных аминов - катехоламинов,  серотонина, гистамина приводит к быстрому накоплению окрашенных полимерных| продуктов. Например, после введения в олеиновую кислоту серотонина (в 75%-ном метиловом спирте) или адреналина (в капле ледяной уксусной кислоты) в концентрации 2,5·10^-3 количество липополимеров через 2-Зmin составляло 1,3-1,5% от исходной массы кислоты. Фракционирование на колонке с сефадексом LН-20 (элюирующая смесь хлороформ-метанол 1:1), калиброванной по полиэтиленгликолю,  показало, что максимальная молекулярная масса полимеров превышает 6.000 дальтон. Эти результаты привели к выводу, что добавление биогенных аминов к олеиновой кислоте равнозначно повышению температуры ее окисления до 200-400°С (в зависимости от добавленного амина). Полимеры, образующиеся в олеиновой кислоте под действием различных аминосоединений, различаются между собой по спектрам поглощения и флуоресценции [15].

Эксперименты на мышах показали [16, 17], что полимеры, извлеченные из олеиновой и линолевой кислот, обладают выраженным физиологическим действием, сходным с действием тех биогенных аминов, под влиянием которых эти полимеры образовались. Так, внутрибрюшинная инъекция мышам  омыляемой фракции полимеров, образовавшихся в линолевой кислоте под действием серотонина, вызывает те же изменения некоторых показателей крови, что и сам серотонин (таблица). Отметим, что вводимая животным полимерная фракция не содержала серотонина.

 

Таблица. Изменения некоторых биохимических показателей крови крыс после инъекции серотонина (10 mg/kg) и липополимеров (250 mg/kg)

 

 

Это было установлено с помощью высокочувствительной флуориметрической методики [21]. Инъекция мышам омыляемой фракции полимеров, образовавшихся в термически окисленной линолевой кислоте (165°С, 24 часа) не влияла на те же показатели крови. Внутрибрюшинная инъекция мышам в дозе 250mg/kg полимеров, образовавшихся в олеиновой кислоте под влиянием адреналина, приводила животных в состояние сильного возбуждения, сопровождающегося судорогами всего тела. Увеличение дозы до 750mg/kg вызывало мгновенную гибель мышей.

Известно [22, 23], что катехоламины,  серотонин и,  по-видимому, гистамин образуют простагландины при взаимодействии с циклическими эндопероксидами ненасыщенных жирных кислот. По-видимому, мономеры в полимерах, образующихся в ненасыщенных жирных кислотах под влиянием биогенных аминов, представляют собой простагландины и простагландиноподобные соединения.

Значительная часть вводимых мышам липополимеров поступает в селезенку. Динамика накопления полимеров в селезенке регистрировалась по поглощению в растворе липидов в хлороформе при длинах волн 245 nm и 400 nm (регистрация окраски полимеров). Липиды из селезенки извлекали хлороформ-метанольной смесью (2:1) [24]. Опытной группе мышей вводили внутрибрюшинно в дозе 150mg/kg полимеры,  образовавшиеся в олеиновой кислоте под действием адреналина. Контрольной группе животных вводили в той же дозе полимеры, образовавшиеся в термически окисленной олеиновой кислоте (165°С, 24 часа). Было обнаружено [15], что величина поглощения при 245 nm в липидах селезенки опытной группы, достигнув некоторого максимального значения,  в дальнейшем изменяется незначительно. В то же время, величина поглощения при 400nm достигнув максимума, затем резко снижается (рис.1). То есть, если судить по поглощению при 245nm, то полимеры остаются е селезенке.

Если же ориентироваться по поглощению при 400nm , то уже через 1,5 часа после инъекции полимеры е селезенке отсутствуют. Эти результаты заставляют предположить, что полимеры в селезенке животных подвергаются химическому превращению, в результате которого исчезает их окраска. По-видимому, происходит деполимеризация структуры полимеров. После инъекции полимеров из термически окисленной олеиновой кислоты мышам контрольной группы динамика поглощения в липидах селезенки при 400 nm имеет тот же вид, что и при 245nm (рис.2).

В селезенке мышей быстро обесцвечиваются также полимеры, образующиеся в олеиновой кислоте под влиянием серотонина, гистамина, а также таких аминосоединений как β - меркаптоэтиламин, амиэтилизотиуроний, гидроксиламин, мексамин и др. В то же время окраска полимеров, образовавшихся в олеиновой кислоте под влиянием цистамина, сохраняется в липидах селезенки при наблюдении в течение более 3-х часов.

Внутрибрюшинная инъекция мышам и крысам в субтоксических (радио защитных) дозах биогенных аминов, а также глутатиона, цистеина и перечисленных выше аминосоединений, также приводит к появлению в селезенке и других органах полимерных продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот (рис. 3) [15].

В течение пяти суток после тотального рентгеновского облучения мышей в дозе 750r в селезенке появляются два четко выраженных максимума концентрации липопигментов, регистрируемых по поглощению раствора липидов в хлороформе при 400nm. Первый максимум приходится на время 6-12 часов после облучения, второй, более значительный, на 3-5 сутки [14]. Появление первого максимума совпадает по времени с развивающимся поражением и деструкцией наиболее радиочувствительных клеток - кроветворных органов и зародышевой ткани. Второй подъем концентрации липопигментов коррелирует с дегенеративными изменениями и массовой гибелью клеток слизистой кишечника (кишечный синдром).

Фракционирование липидов селезенки на колонке с сефадексом LН-20 показало, что максимальная молекулярная масса липополимеров превышает 4.000 дальтон. Содержание липополимеров на 4-е сутки после облучения составляло до 40% от общей массы липидов селезенки. На основании изложенного материала предполагается участие полимерных продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот в следующих биологических процессах.

Иммунологическая реакция. В повседневной жизни животные и человек подвергаются стрессорным воздействиям, дестабилизирующим внутреннюю среду организма. Предполагается, что иммунологическая реакция включается при действии на организм любого стресс-фактора, инициирующего повреждение и деструкцию клеток тканей. С этой точки зрения патогенные бактерии, вирусы, грибы и простейшие также следует рассматривать как стресс-агенты. На изменения во внутренней среде организма реагирует диффузная эндокринная система [25,26], гормонопродуцирующие клетки которой рассеяны в эпителиальных и соединительных тканях фактически всех органов. В активации диффузной эндокринной системы участвует, по-видимому, гипофиз-адреналовая система (гормоны коры надпочечников). В ответ на повреждение ткани клетки местной диффузной эндокринной системы реагируют выделением избыточных количеств биогенных аминов, В состоянии стресс-реакции организма высокие концентрации катехоламинов, серотонина, гистамина действуют как катализаторы окислительной полимеризации ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов плазматической мембраны. Поскольку липиды в мембране ассоциированы с белками, то результатом действия массированных доз биогенных аминов на клетку является образование окрашенных липопротеинов полимерной структуры. Образование липопротеиновых комплексов может происходить за счет прочных химических связей между липополимерами и белками, а также в результате гидрофобных взаимодействий [27, 28]. Часть полимерных липопротеинов проникает в цитоплазму, образуя, в конечном итоге, внутриклеточные липофусциновые гранулы. Значительно большая часть липопротеинов отрывается от плазматической мембраны клеток и поступает в лимфу, лимфатические узлы, селезенку, печень. В селезенке полимерные липопротеины поглощаются макрофагами, где липополимеры подвергаются деструктуризации с последующей инактивацией физиологически активных структурных единиц. Макрофаги представляют высвобождающиеся белковые антигены Т-лимфоцитам, что инициирует антигенспецифический иммунный ответ.

В действии биогенных аминов на клетки отсутствует избирательность. По этой причине макрофаги представляют антигены нормальных, функционально неполноценных, дефектных, патологически измененных и других клеток собственного организма. Кроме этого, макрофаги представляют также антигены патогенных бактерий, вирусов, грибов и простейших, повреждающих и разрушающих клетки тканей. Эти антигены связываются с липидами в процессе их полимеризации, протекающей по свободно радикальному механизму. По-видимому, липопротеины полимерной структуры нужно рассматривать как естественный стимулятор иммунной системы или как пусковой механизм иммунологической реакции. Введение здоровым крысам липополимеров, извлеченных на 4 суток из селезенки крыс, облученных в дозе 800Р, инициировало включение иммунологической реакции.

Диффузная эндокринная система, иммунная система, а также органы чувств и рецепторы эпителиальных тканей, связанные с пептидергическими нейронами нервной системы, рассматриваются как отдельные звенья общей системы первичного реагирования,  оповещения и защиты организма [26].

Старение и спонтанный канцерогенез. Предполагается,  что поступающие в постмитотические клетки продукты окислительной полимеризации ненасыщенных жирных кислот являются первичной и основной причиной старения организмов.  Косвенным подтверждением этого предположения служат известные литературные данные. Так, накопление липопигмента в клетках вызывает пропорционально усиливающееся разрушение цитоплазматических структур, например, уменьшение массы цитоплазмы, числа митохондрий, шероховатого эндоплазматического ретикулума, упрощение аппарата Гольджи и образование в цитоплазме вакуолей [29]. Четко выраженные примеры связи процесса старения с липофусциногенезом дают некоторые генетические заболевания человека. Так, прогерия характеризуется значительным отложением возрастного пигмента в клетках многих органов уже в раннем возрасте. Ребенок в 9 лет напоминает 70-летнего человека. При этом наблюдаются такие старческие симптомы как атеросклероз, поседение волос и др. [30, 31].

Токсическое действие термических окисленных жиров пропорционально содержанию в них полимерных продуктов [32, З3].  Введение е рацион крыс полимерной фракции,  выделенной из перегретого кукурузного масла,  в количестве 2,5% от диеты,  приводит к гибели животных в течение 7 дней [39]. Липополимеры,  образующиеся в олеиновой кислоте под влиянием биогенных аминов, угнетают дыхание гомогената печени свиней [17].

На рис.4 показана кинетика накопления перекисных соединений в олеиновой кислоте, окисляющейся при 75°С с добавками витамина Е, канцерогенного полициклического углеводорода 3,4-бензпирена и полимеров, образовавшихся в олеиновой кислоте под влиянием серотонина. Отметим, что процесс торможения окислительного процесса 3,4-бензпиреном и липополимерами длится неопределенно долгое время. Согласно Варбургу, канцерогенные химические соединения являются агентами, нарушающими окислительное фосфорилирование. При изучении распределения углеводородов в клетках эпителия кожи мышей, смазывавшейся 3,4-бензпиреном, была обнаружена (с помощью флуоресцентной микроскопии) наивысшая концентрация канцерогена в митохондриях [34].

Выше было предложено, что мономеры в полимерах, образующихся в ненасыщенных жирных кислотах под влиянием биогенных аминов, представляют собой простагландины и простагландиноподоные соединения. Известно, что простагландины разобщают окислительное фосфорилирование, что рассматривается как главное звено механизма их действия на клетку [35]. Эти данные, а также антиокислительные свойства липополимеров и их способность угнетать тканевое дыхание, позволяют утверждать, что липополимеры также являются агентами, нарушающими окислительное фосфорилирование. Митохондрии являются основным источником внутриклеточной энергии. Наряду с уменьшением числа митохондрий, в клетках стареющего организма имеются митохондрии с признаками явной деградации, которая выражается более частой отслойкой наружной мембраны, уменьшением числа крист, набуханием, отложением пигмента др. Размер гранул внутримитохондриального пигмента увеличивается в процессе старения [36]. Большинство имеющихся данных убедительно показывает, что в старости происходит значительная активация гликолитической фазы энергетического обмена преимущественно за счет реакций гликогенолиза. По мере старения происходит снижение общего газообмена и активности окислительных процессов [37]. Поступающие в клетки липополимеры создают прогрессирующий с возрастом дефицит энергии. В результате процессы обновления и восстановления функциональных клеточных структур все больше отстают от процессов их повреждения, инактивации и разрушения. Липопигменты, образующие гранулы в клетках, неактивны, тем более, что они часто заключены в однослойную мембрану. Однако, действующие на организм стресс-факторы обеспечивают почти непрерывное поступление в клетки новых порций липополимеров. Показано, что в симпатических вагальных ганглиях человека 7% общего количества липофусцина накапливается в первом десятилетии жизни, 8-14% - во втором и 30-33% - в пятом [38, 39].

Определяющую роль в образовании липофусцина у человека и животных играет последовательное чередование стрессорных воздействий и ситуаций,  возникающих в повседневной жизнедеятельности и вызывающих дестабилизацию внутренней среды организма. Липофусциновые пигменты появляются, вероятно, под влиянием любого воздействия, выходящего за пределы физиологического стимула. Скорость накопления липофусцина у животных разных видов определяется, с одной стороны, чувствительностью систем организма, с другой - частотой изменений в самой среде [3]. Старение организма, обусловленное поступлением в клетки липопигмента, есть побочный (сопутствующий) негативный результат деятельности общей системы первичного реагирования, оповещения и защиты организма [26].

Реасосk [40, 41] получал саркомы у мышей в месте введения перегретого холестерина, его эфиров и перегретого хлопкового масла. Lane и сотрудники [42] также наблюдали возникновение сарком у 10% крыс, которым вводился подкожно перегретый лярд или растительное масло. Полимеризованные ненасыщенные растительные масла вызывали возникновение сарком у крыс в месте инъекции [43].

Многими исследователями было замечено увеличение числа ядер в тканях старых особей, увеличение доли полиплоидных клеток [37]. Этот факт свидетельствует о том, что соотношение между ослабленным дыханием и усиливающимся гликолизом в клетках таково, что клетки находятся в состоянии постоянной, непрерывной стимуляции клеточного деления [44]. Делению, однако, может препятствовать высокий уровень дифференцированности и специализации клеток. Поскольку липофусцин образуется и в делящихся клетках [45], то такие клетки могут быть предшественниками опухолевых клеток.

 

 

Рис 1. Динамика поглощения при 245nm (1) и 400nm (2) в растворе липидов селезенки в хлороформе после инъекции мышам полимеров (олеиновая кислота + адреналин). Пунктирными линиями обозначены величины поглощения при 245nm и 400nm в липидах селезенки интактных мышей.

 

Рис. 2. Динамика поглощения при 245nm (1) и 400nm (2) в растворе липидов селезенки в хлороформе после инъекции мышам полимеров (олеиновая кислота + 165°С, 24 часа). Пунктирными линиями обозначены величины поглощения при 245nm и 400nm в липидах селезенки интактных мышей.

 

 

 

 Рис. З. Динамика поглощения при 400nm в растворе липидов в хлороформе после инъекции мышам адреналина в дозе 4mg/kg. 1- костный мозг, 2 - селезенка, 3 - тонкий кишечник, 4 - кровь. Пунктирными линиями обозначены величины поглощения в липидах соответствующих тканей интактных мышей.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 4. Кинетика накопления перекисей в олеиновой кислоте, окисляющейся при 75°С с добавками: 1 - 3,4-бензопирен (3·10-3mol/l),  2 - витамин Е (3·10-3mol/l),  3 - полимеры (0,1%), образовавшиеся в олеиновой кислоте под влиянием серотонина; 4 - олеиновая кислота, контроль.

 

ЛИТЕРАТУРА

[1] Hendley D.D., Mildvan A. S., Reporter M. C., Strehler B.L. 1963. J. Geront., 18, 250.
[2] Bjorkerud S. 1964. Advan. Geront. Res., 1, 257.
[3] Strehler B.L. 1962. Time, cells and ageing. Acad. Press, New York.
[4] Ruppel W. 1949. Arch. Exptl. Pathol. Pharmacol., 206, 584.
[5] Mason K. E. 1954. Vitamins, 3, 514.
[6] Filer L. J., Rumery R. E., Mason K. E. 1946. In : Biological Antioxidants. New York, T. Macy, 67.
[7] Ueno A., Inone M., Sugai M., Bhalerno V., Kummerow F. A. 1960. Federation Proc., 19, 19.
[8] Perkins E. G. 1960. A review Food Technol., 14, 508.
[9] Dillard C. J., Tappel A. L. 1971. Lipids, 6, 715.
[10] Tappel A. L., Fletcher B., Deamer D. 1973. J. Geront., 28, 415.
[11] Strehler B.L. 1964. Advan. Geront. Res., 1, 343.
[12] Perkins E. G., Taubold R., Hsich A. 1973. J. Am. Oil Chem., 50, 223.
[13] Sedlacek B. A. J. 1969. Fette-Seifen-Anstrichsmittel, 2, 133.
[14] Vertushkoff V. T., Ivanov I. I., Tarusov B. N. 1973. Радиобиология (Radiation Biology), 13, 3, 723.
[15] Vertushkoff V. T., Ivanov I. I., 1974. Радиобиология (Radiation Biology), 14, 1, 39.
[16] Vertushkoff V. T., Tarusov B. N., Ivanov I. I. 1976. In: Free- radical oxidation of lipids in norm and pathology. M., "Nauka", 27.
[17] Vertushkoff V. T. 1977. Успехи современной биологии (Modern Biology Achievements), 83, 3, 357.
[18] Lee K. J., Witte P. D. 1913. J. Med. Sci., 145, 495.
[19] Andreyenko G.V., 1962. Hematology and Blood Transfusion Problems. 7, 9.
[20] Bidwell E. 1953. Biochem. J., 55, 497.
[21] Miller F. P., Maickel R. P. 1970. Life Sci., 9, 1, 747.
[22] Akio J., Hiroynki J., Kenkichi T. 1970. J. Biochem., 68, 4, 487.
[23] Sih C. J., Takeguchi C., Foss P. 1970. J. Amer. Chem. Soc., 92, 22, 6670.
[24] Folch B. J., Lees M., Sloane-Stanley G. H. 1957. J. Biol. Chem., 226, 497.
[25] Feyrter F. Z. 1951. Mikr.-anat. Forshung, B. 57, S. 324.
[26] Yaglov V. V., Lomonosova G. A. 1985. Успехи современной биологии (Modern Biology Ahievements), 99, 2, 264.
[27] Pokorny J. 1963. Fette-seifen-Anstrichsmittel, die Ernahrungsindustrie, 65, 278.
[28] Pokorny J., Janicek G. 1968. Nahrung, 18, 21.
[29] Shimasaki H., Nozawa T., Privett O. S., Anderson W.R. 1977. Arch. Biochem. Biophys., 183, 443.
[30] Reichel W., Garcia- Bunnel R., Dilallo J. 1971. J. Geriat. Soc., 19, 369.
[31] Kanungo M. S. 1982. Biochemistry of Aging. M., "Mir".
[32] Friedman L., Shue G. M., Douglas C.D., Firestone D. 1961. Federation Proc., 20, 369.
[33] Kummerow F. A. 1962. In: Lipids and their oxidation. Westport, USA, 294.
[34] Graffi A. 1940. Z. Krebsforsch. 49, 477; 50, 196; 50, 501.
[35] Kudryavtseva G. V. 1979. Успехи современной биологии (Modern Biology Achievements), 88, 1(4), 50.
[36] Goldstein B. I., Rud' S. G., Polyakova L. L. 1966. Med. Chem. Matters, 12, 618.
[37] Razumovich A. N. 1972. Bioenergetic Processes and Ageing of Organism.Minsk, "Nauka i Technika". [38] Herman H. 1852. Z. Alternsforsch., 6, 197.
[39] Nanda B. S., Getty R. 1973. Exp. Geront., 28, 1.
[40] Peacock P. R. 1946- 1947. Brit. Med. Bull., 4, 364.
[41] Peacock P. R. 1948. Brit. J. Nutrition, 2, 201.
[42] Lane A., Blickenstaff D., Ivy A. C. 1950. Cancer, 3, 1044.
[43] Kraybill H. F., Shimkin M. B. 1964. In: Advances in cancer Research, 8, 204.
[44] Vertushkoff V. T. 2000. Regulation of cell division and tumor growth.

[45] Essner E., Novikoff A. J. 1960. Vitra Res., 3, 374.